一、食品中大肠菌群，粪便大肠菌群和大肠杆菌的测试实验介绍

1、大肠杆菌的检测技术可适用于食品中大肠菌群，粪便大肠菌群和大肠杆菌的测试。

2、大肠杆菌的检测技术也可适用于航空食品检验。

二、大肠杆菌的测试实验的试剂

1、移液器（1ml，10ml），恒温培养箱（36±1℃，44.5±0.5℃），冰箱，匀浆器，振荡器，培养皿，替换瓶，天平，显微镜等。

2、培养基和试剂

十二烷基硫酸盐磷脂蛋白（LST）肉汤，亮绿色乳糖胆盐（BGLB）肉汤，EC肉汤，曙红蓝琼脂（EMB），营养琼脂斜面，色氨酸肉汤，MR-PV培养基，科瑟柠檬酸盐肉汤，结晶紫中性红胆汁盐琼脂（VRBA），巴特菲尔德（Butterfield）的磷酸盐缓冲液替代品，生理盐水，革兰氏染色溶液，科瓦奇（Kovacs）的衍生物或试剂，碱红色指示剂，Voges-proskauer（VP）试剂。

序号 产品 货号 CAS号 备注

1 1000ul吸头 FT-1000-H

2 10ml宽口吸头 FT-10000K

3 10ml窄口吸头 FT-10000Z

4 双料月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） PYJH50625

5 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤 PYJH50387

6 EC肉汤 PYJH50073

7 伊红美蓝琼脂（EMB） PYJH51848

8 营养琼脂 PYJH51818

9 色氨酸肉汤 PYJH50987

10 MR- PV培养基

11 Korser氏枸掾酸盐肉汤

12 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA） PYJH50078

13 Butterfield氏磷酸盐缓冲替代液

14 生理盐水 FS0033 7732-18-5

15 革兰氏染色液 HC0448

16 Kovacs氏衍生物

17 甲基红指示剂 FF0001 493-52-7

18 Voges-proskauer（VP）试剂 PYJH51610

以上是实验采用的试剂，请采用高品质的范德生物的生化试剂。

三、大肠杆菌的测试实验样品制备

1、样品制备：无菌采集所需样本，并将其放入无菌容器中。如果已包装，请使用75％的乙醇擦拭包装的开口并取样。

2、样品匀浆的制备：无菌操作取25g样品，加到225ml替代品的无菌均质杯中，以8000r / min均质1-2min，以1:10均质。如果样品的均质时间超过2分钟，则应在均质杯中加冰水冷却。

3、稀释样品匀浆：使用10ml无菌吸管准确吸取10ml 1:10均质的样品溶液，并将其放入150ml的90ml替换剂替换瓶中。快速摇动并混合样品以制成1：100的样品溶液。

四、食品中大肠菌群的测定

①大肠菌群MPN值的测定

1、对于每个样品，选择具有三个连续更换度的合适样品更换溶液。为每个取代度混合三支月桂基硫酸微蛋白每月（LST）肉汤试管，并向每支试管中注入1ml。

2、将植入管在36±1℃下放置48±2h。

3、观察试管的气体产生情况：检查倒试管中是否有气泡，并记录在24h和48h内产生气体的LST肉汤管的数量。如果所有LST肉汤管均未产生气体，则可将其报告为大肠菌阴性。如果有气体发生，则需要进一步的确认测试。

②大肠菌的确证试验

1、将所有直径为3mm的气管插管移植到鲜绿色乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中。

2、将BGLB肉汤管置于36±1℃，孵育48±2h。

3、记录所有BGLB肉汤管的气管管数。

4、结果报告：根据BGLB肉汤产生的气管数量，检查MPN表以报告大肠菌群每克（ml）的MPN值。

五、粪便大肠菌群的测定

1、用植入环将所有产气LST肉汤管培养物移植到EC肉汤管中。

2、在30分钟内将所有植入的EC肉汤管放入44.5±0.5℃水浴中，孵育24±2h。水浴液位应高于肉汤培养基的液位。已知在44.5℃时对气体呈阳性的大肠杆菌和在44.5℃时的产气肠杆菌或其他大肠菌可作为阳性和阴性对照。

3、记录EC肉汤管的产气量。气管试管中粪便大肠菌群呈阳性。非生产管经检测粪便大肠菌呈阴性。

4、结果报告：根据气管数量，检查MPN表并报告每克样品中大肠菌群的MPN值。

六、大肠杆菌的测试实验测定

1、继续将第6.3条中的EC肉汤管培养24小时，并将气管试管的培养物条纹成曙红亚甲基蓝（EMB）板，在36±1℃下培养24±2h。

2、检查平板上是否有典型的带有黑色中心光泽或亚光的菌落。

3、如果有典型的菌落，请从每个培养皿中至少选择2个典型的菌落。如果没有典型的菌落，则从每个培养皿中至少选择2个可疑菌落。用植入针触及菌落中心，移植到营养琼脂斜面上，在36±1℃下孵育18-24h。

4、将倾斜培养物移植到以下培养基中进行生化测试。

①色氨酸肉汤：在36±1℃下孵育24±2h后，加入0.2-0.3ml的Kovacs试剂，上层显示为红色，为多阳离子反应。

②MR-VP培养基：36±1℃培养48±2h。将1ml培养物无菌转移到13mm * 100mm试管中，加入0.6ml 5％萘酚乙醇溶液，0.2ml 40％氢氧化钾溶液和少量肌酸晶体，摇动试管，静置2h，如果出现，则红色为VP测试的正极。

再将MR-VP培养物的其余部分孵育48小时，然后加入5滴甲基红溶液。如果培养物变为红色，则甲基红测试为阳性，如果其变为黄色，则为阴性。

③寇瑟柠檬酸盐盐酸盐肉汤：记录在36±1℃下生长96h。

④ LST肉汤：在36±1°C下孵育48±2h，并观察试管中是否产生气体。

⑤革兰氏染色：采取18h营养琼脂倾斜培养进行革兰氏染色。大肠杆菌是革兰氏阴性的。

⑥大肠杆菌和非抗生素的生化鉴定如下

上表以外还有其他生化反应类型，则表明培养物可能不纯，应重新划线和分离，必要时重复测试。

⑦结果报告：大肠杆菌是革兰氏阴性杆菌，发酵乳糖产生酸和气体，IMViC测试是 -或- -，然后根据LST肉汤阳性试管的数量检查MPN表并报告每克（ml）样品中大肠杆菌的MPN值。

注：本文参照SN0169-92《出口食品中大肠菌群，粪便大肠菌群和大肠杆菌的测试方法》

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