乙酰CoA是胆固醇合成的直接原料，它来自葡萄糖、脂肪酸及某些氨基酸的代谢产物。另外，还需要ATP供能和NADPH供氢。合成1分子胆固醇需消耗18分子乙酰CoA、36分子ATP和16分子NADPH。
合成途径可分为5个阶段：
1、乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A生成二羟甲基戊酸；
2、从二羟甲基戊酸脱羧形成异戊二烯单位；
3、6个异戊二烯单位缩合生成鲨烯；
4、鲨烯通过成环反应转变成羊毛脂固醇；
5、羊毛脂固醇转变成胆固醇。
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