超氧化物歧化酶（SOD）是生物体系中抗氧化酶系的重要组成成员，广泛分布在微生物、植物和动物体内。其是在上个世纪末才被发现，可以说是生物医学研究史上的一项重大成果,于人类生命研究具有极其重要的意义。今天我们就给大家分享一下如何通过比色法测定植物酶活SOD。

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所有试剂除注明者外，均为分析纯。

1.1 磷酸缓冲液：

A液：0.2M的KH2PO4溶液 分析纯KH2PO4  27.216克，用蒸馏水定容至1000毫升。 

B液：0.2M的K2HPO4溶液 分析纯K2HPO4•3H2O 45.644克，用蒸馏水定容至1000毫升。

或 

A液：0.2M的NaH2PO4溶液 分析纯NaH2PO4•2H2O  31.21克，用蒸馏水定容至1000毫升。 

B液：0.2M的Na2HPO4溶液  分析纯Na2HPO4•12H2O 71.64克，用蒸馏水定容至1000毫升。

1.2 母液的配制： 

（1）0.5M 磷酸缓冲液（PH=7.8）：A液21.25ml B液228.25ml定容至1000ml； 

（2）130mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399克Met 用磷酸缓冲液（PH=7.8）定容至100ml； 

（3）750μM四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液（PH=7.8）定容至100ml(避光保存)； 

（4）100μM EDTA-Na2：取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液（PH=7.8）定容至1000ml； 

（5）20μM FD (核黄素)：0.00753gFD用磷酸缓冲液（PH=7.8）定容至1000ml（现配现用）。 

1.3 SOD反应液： 

磷酸缓冲液（PH=7.8）：Met：NBT：EDTA-Na2：核黄素（FD）：H2O的比例为15：3：3：3：3：2.5，按母液顺序配制。 

万分之一分析天平、紫外分光光度计、医用离心机、研钵

取新鲜样本剪碎充分混匀后，装入样本瓶放入4℃冷藏备用。

4.1 酶液的制备： 

称取鲜样0.5g放入研钵中，加5毫升PH=7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，冷冻离心20分钟（10000×g），上清液（酶液）倒入试管中，置于0～4℃下保存待用。 

4.2 SOD的测定 

取型号相同的试管，吸取20ul的酶液，加入3ml反应液，4000Lux照光（多用为环形日光灯的光照培养箱）30分钟（尽量做到照光情况一致）

4.3 空白与对照的制备

同时取四支试管，三支做对照（CK），一支做空白（不加酶液，以缓冲液代替）；空白置暗处，对照（CK）与酶液同至于4000Lux条件下照光30分钟，遮光保存，以空白调零，560nm比色。 

4.4 若光照后颜色过深，可适当多取酶液进行测定

SOD总活性（吸光度/g·FW）=（ACK—A）×V／（W×0.5×ACK）

式中：

ACK--为对照在560nm下测得的吸光度；

A--为试样在 560nm下测得的吸光度；

V--为提取液体积，ml；

W--为称取试样鲜重的质量，g；

0.5--为光照时间，h；

单位：NBT光还原50%为单位 

SOD比活性（酶单位/mg蛋白）= SOD总活性/可溶性蛋白质浓度

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